红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)

　　目的：HA抗原的血凝价

　　HI：测鸡的抗体滴度

　　试验准备：1.抗原：IV或CO30，配比：1瓶加1-2ml生理盐水。或买鸡ND血凝抑制抗原或鸡AI血凝抑制抗原

　　0.5%-1%的红细胞悬浮液：

　　1.采血:鸡翅三角处，放入灭菌试管(10ml血加入肝素钠1.5ml)迅速混匀。

　　肝素钠稀释倍数是1ml:100ml生理盐水。

　　2.红细胞悬液的配制:将血液注入离心管中，经1500-2000转，离心15分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上的白细胞薄膜，(使用时必须相对应放入生理盐水来给离心机配平)

　　将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤，在用离心机1500-2000转/分钟，离心15分钟，弃去上清液，再加生理盐水洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.5%-1%的稀释度加入稀释液(0.5或1ml红细胞泥加99.5/99ml生理盐水)放入4摄氏度冰箱保存，可保存两周。

　　3.被检血清：血清制备方法：用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内，在室温中静置，待血清析出后使用。(做病毒试验时，不怕细菌感染)每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。方法二：放在平皿中放入4摄氏度中过夜，取上清液。

　　4.稀释液：为灭菌的生理盐水。

　　红细胞凝集试验:

　　测病毒的红细胞凝集价(抗原血凝价)方法如下：

　　1.每个孔加入稀释液50ul

　　2.用微量加样器取病毒抗原液50ul加入第1孔内，反复吹打10次，使病毒与稀释液混合均匀，再用微量加样器从中吸取50ul移入第2孔内，在反复吹打10次，连续至11孔，然后弃去。12孔做红细胞对照。

　　3.加0.5-0.1%红细胞悬浮液50ul，轻轻用手拍打，放37摄氏度温箱，15分钟观察结果。

　　红细胞凝集抑制试验:

　　目的：测鸡血清中的HI抗体效价(滴度)

　　具体操作如下：用微量加样器从第1孔到第12孔每孔各加入25微升稀释液，其中第11孔加稀释液50微升。用微量加样器吸取被检血清25微升，放入第1孔，吸吹10次混匀后，再移液25微升至第2孔，如此连续稀释至第10孔。从第10孔取出25微升弃掉。血清稀释倍数依次为1：2~1:1024。用微量加样器从第1孔至第10孔依次各加入含有四个单位的病毒液25微升。第11孔为红细胞对照孔，不加病毒液。第12孔加入含有四个单位的病毒液25微升，作为抗原对照。置振荡器上振荡1~2分钟后，18~22℃静置20分钟。每孔再加入0.5%的红细胞悬浮液25微升，放在振荡器上振荡1~2分钟混匀后，加盖置37℃温箱中作用30分钟后判定结果。

　　HI抗体效价(滴度)判定标准：

　　HI滴度<2，攻毒后100%死亡，

　　HI滴度在2-5攻毒后死亡率为10%，

　　HI滴度在4-6，攻毒后不死亡，

　　HI滴度在6-8，降蛋严重，无死亡，康复后滴度达14或更高，

　　HI滴度在9-11，不降蛋，无死亡，康复后滴度达11-12，

　　HI滴度在11-13，鸡群可以保持无降蛋，保护可达6个月以上。