一、家禽免疫抑制病概述

家禽的免疫抑制病原中最主要有传染性法氏囊病毒（IBDV）、马立克氏病毒 1型(MDV)、鸡传染性贫血病毒（CIAV）、J 亚群禽骨髓性白血病病毒（ALV-J）。此外，新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、呼肠弧和网状内皮增殖病病毒也是免疫抑制性的，考虑到普遍性在本研究中重点关注前六种。

家禽免疫抑制病导致的直接损失和间接损失巨大（Van Elden et al., 2001）。此类家禽免疫抑制相关病传染性强，会引起免疫器官、组织和免疫细胞损害而导致暂时性或永久性免疫应答功能不全或低于正常水平，常会导致整个禽群的生产力下降，死亡率增加。免疫抑制相关病还会使疫苗接种不能达到预期免疫效果，导致免疫失败，家禽对其它感染性疾病的易感性增加，间接损失巨大。因此，关于家禽免疫抑制病的快速检测方法日渐成为研究的重点。

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）所引起的一种具有急性、接触传染性的疾病，主要以法氏囊发炎、坏死、萎缩以及法氏囊内的淋巴细胞严重受损为特征，能够引起家禽的免疫机能障碍，而且会干扰各种疫苗的免疫效果。这种病的发病率很高，几乎达 100％，死亡率一般为 5％～15％，是目前养禽业面临的最重要的疾病之一。

鸡传染性贫血病是由鸡传染性贫血病毒(Avian Infectious Anaemia Virus，CIAV)引起的，以再生障碍性贫血、淋巴器官组织的萎缩、皮下和肌肉出血、泛血细胞减少为主要特征，本病存在于所有主要养禽业国家。1979 年首次于日本报道，中国于1992 年首次分离到该病病毒，随后周文平等在河南、山东省、江苏省、辽宁省、吉林省等地区的鸡群中也陆续分离到 CIAV。此病主要通过垂直传播、水平传播造成临床与亚临床的感染。鸡传染性贫血病及其诱发的疾病每年给养禽业造成巨大的经济损失。

J 亚群禽白血病是由 J 型禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus subgroup J，ALV-J)所引起的一种传染病，该病主要发生于肉用型鸡，主要引起家禽的骨髓细胞瘤。我国于 1999 年首次分离到了 ALV-J。该病毒的致病性试验表明，其不仅通过髓细胞瘤引起肉鸡较高死亡率外，还可引起鸡体质量严重下降，雏鸡感染后其生长性能降低。

其可通过水平传播和垂直传播迅速地感染整个鸡群，使鸡群在短时间内遭受灭顶之灾。

马立克氏病是由疱疹病毒科鸡疱疹病毒 2 型(马立克氏病毒 1 型，Serotype  I Marek's Disease  Virus)引起的一种传染性肿瘤病。该病于 1907 年由匈牙利兽医病理学家马立克首次发现，是国外 50 年代以来最受重视的禽病，呈世界性分布，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，产生免疫抑制,干扰各种疫苗的免疫效果。病毒经空气传播,传染力强,被感染禽类产生肿瘤和死亡,对养殖业造成了巨大经济损失。

新城疫（newcastle  disease,ND）是由新城疫病毒所引起的禽类传染病，该病是一种急性、热性、败血性和高度接触性的传染病。主要高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。

禽流感病毒（AIV）属甲型家禽免疫抑制性病毒（Gaidet et al., 2007）。禽流感病毒属于 RNA 病毒的正黏病毒科，传染性强，各种日龄禽类均易感，且易导致死亡，目前已经成为威胁动物和人类健康的重要病毒之一。

二、常见检测方法

上述疫病的现有检测方法（曲萌等，2003）主要有分离培养、电镜检查、琼脂扩散试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、PCR 等方法（赵静等，2002），其主要原理和优缺点主要有：传统的分离培养法通常是将病原体进行一定的倍比稀释后，根据其所需要的温度、时间、是否厌氧等特性进行模拟环境因素培养，最后在显微镜的镜下进行放大观察，根据观察到的形态和颜色等物理特征进行人工辨认。传统的分离培养法的优势是只需要培养器皿、显微镜等设备就可以进行，成本不高容易控制。劣势则是病原体的培养所需时间较长，一般会达到 3~6d；对操作人员的经验要求较高，没有一定经验基础的人员无法辨认或容易认错一些表型出现变异的毒株；部分检测工作的强度和难度很大，强度在于对所需确认的每种类型都需要一一进行分离培养，难度在于有时需要模拟一些特殊苛刻的培养要求。

电镜检查法电镜检查法的成像原理和光学显微镜大致一样，但是也有所区别。

电镜的优势是主要是通过电子扫描制备的复杂样品来进行成像，其分辨率很高可以容易到达纳米级别，劣势是图像为黑白的，而且实际看到的只是样品的在某一时刻拍的静止照片，同时在制备样品时过程比较复杂，对条件的要求也比较高，而光学显微镜的优势则是可以进行动态和实时的查看，劣势是分辨率受到了入射光的衍射限制，如果被观察对象的大小小于入射光的波长的一半就无法看到。两者之间各有长短，常常在工作中结合具体实际应用情况来进行。

琼脂扩散试验琼脂扩散试验的实质是一种沉淀实验，主要利用可溶性的抗原、抗体的分子在半固态的琼脂凝胶的过程中相遇后达到一定比例，产生结合和凝集并形成白色可见的沉淀，这种沉淀能被肉眼所观测到。琼脂扩散试验是一种非常简洁、快速的病原体诊断和抗体效价测定方法（罗平恒等，2013），其主要优势是可以用做定性实验或者要求不太精确的定量实验，实验结果简单清晰。劣势是需要的时间比较长，而且反应的灵敏度不够高，其结果是通过比对标准曲线来人工求得，所以不如 ELISA 实验客观。

酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验主要是通过酶的强烈催化作用使无色的底物发生一定的化学反应形成有颜色的产物，然后人工进行观察或用分光光度仪进行含量检测。该试验的优势是在每次加入试剂孵育后，进行洗涤以去除多余的游离状态的反应物，具有很好的特异性和敏感性；试验可以通过不同的步骤和方法设计来达到不同的试验目的，如双抗体夹心法、间接法，使用灵活；试验快速并且结果可靠。劣势是干扰因素太多、重复性不好，其中受温度和时间的影响最大，此外还容易受到自身抗体等因素的干扰而导致结果出现假阳性。

聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）技术是一种酶促化学反应，通过在试管中利用 PCR 技术将需要检测的目的基因在体外短时间内扩增几十万甚至上百万倍，从而极大地提高了诊断结果的灵敏度。

目前主要有定性和定量两种，每种的检测产物方式和扩增的方法都不一样。第一代技术主要是通过琼脂糖电泳的方式对产物进行分析。第二代则是通过荧光定量方式进行，这是一种使用非常广泛的新型核酸定量技术，在普通的 PCR 仪上增加一个激发和检测荧光的装置就变成了荧光 PCR 仪，随着这种仪器在市场上的大量推广，该方法也得到了相关研究人员的积极采用。这一代技术主要是在相对于普通的 PCR 而言在反应体系中加入了一条标记了荧光报告基团 R、荧光抑制基团 Q 共两个基团的标记探针，其中荧光报告基团 R 标记在探针的 5’端，荧光抑制基团 Q 标记在探针的 3’端。3’端的荧光抑制基团 Q 在距离 5’端的荧光报告基团 R 较远时，对后者的抑制作用就会消失，从而导致荧光报告基团 R 的信号变强；如果两者相距较近，则抑制作用会造成最终的信号变弱。在反应过程中每经过一次循环收集一个荧光强度信号，从而通过对荧光信号强度变化来实时监测产物量的变化，达到通过一条荧光扩增曲线来实时检测整个 PCR 的反应过程。在整个扩增的过程中，只有荧光信号指数扩增阶段才存在 PCR 产物量的对数值与起始模板量之间的线性关系，在这之前的荧光背景信号阶段和之后的平台期均因扩增产物变化不明显导致不存在线性关系。目前，该技术已经逐渐发展到以微滴化处理步骤进行的第三代。

常规 PCR 技术相对于其它方式具有其独特的特异性、敏感性优势，但是当这种技术面对多个需要扩增片断时不得不多次反复重复操作步骤，存在无法一次对两对或以上的目标基因序列同时进行扩增的劣势。随着技术的发展，多重 PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction, MPCR）技术应运而生，这种技术通过引入多对的引物来对两对或者两对以上的目标基因序列进行扩增。在体外扩增片断时，同荧光双链探针通常是由两条寡合核苷酸链组成，它们不等长但互补，长链的 5’端标记有一个荧光基团，而其互补链的 3’端标记的是淬灭基团，两个基团靠近时会导致荧光淬灭从而检测不到信号，如果二者分开，荧光信号就会重新出现。多重 PCR 技术成功实现了一次反应中可以检测多重特异基因，在需进行多重检测的情况下具有很高的现实操作使用价值。

反转录多重 PCR 法反转录多重 PCR（multiplex  reverse  transcription  PCR，m RT-PCR）法是在多重 PCR  的基础上再增加了一个反转录的步骤，提取到细菌的m RNA  后通过反转录成 c DNA，并且对 c DNA  进行 PCR  的目的基因序列扩增和后期的分析。因为 m RNA  只会存在于细胞进行复制的过程中，其他事件并不出现，所以用它来替代 DNA  进行 PCR  可以避免死亡菌体的 DNA 对结果造成影响，更为准确的反映出细胞的生存情况是否正常，大大提高结果的敏感性。